Лабораторная диагностика сальмонеллезов

Сальмонеллезы - инфекционные болезни, возбудителями которых являются представители рода Salmonella. Они характеризуются значительным полиморфизмом клинического течения с преимущественным поражением желудочно-кишечного тракта, возможной генерализацией и различной степенью выраженности симптомов общей интоксикации и обезвоживания.

Род Salmonellа входит в семейство Enterobacteriaceae и состоит из микроорганизмов, родственных по фенотипическим и генотипическим свойствам. Ферментативные свойства сальмонелл положены в основу их подразделения на подвиды. Согласно последним данным род Salmonellа представлен двумя видами – S.enterica и S.bongori.

Сальмонеллы вида S.enterica делятся на несколько подвидов.

Деление на подвиды имеет определенное эпидемиологическое значение так как основным, естественным резервуаром сальмонелл подвидов 1 и 2 служат теплокровные животные, а для представителей остальных подвидов (IIIa, IIIb, IV, VI и вида S.bongori (V) – хладнокровные животные и окружающая среда.

Сальмонеллы каждого подвида разделяются на серологические варианты по О- и Н- антигенной характеристике. Современная схема Кауфмана-Уайта насчитывает 2579 серологических вариантов.

Сальмонеллы – лактозонегативные грамотрицательные палочки. Подвижные, имеют по всей поверхности клетки жгутики, D-глюкозу ферментируют с образованием кислоты и газа. Ферментируют рамнозу, ксилозу, арабинозу, мальтозу, дульцит, сорбит, трегалозу, маннит. Сальмонеллы – оксидазонегативные, каталазопозитивные, продуцируют сероводород и не расщепляют мочевину.

Они являются факультативными анаэробами, хорошо растут на обычных питательных средах. Оптимальной температурой роста является 37оС. При температуре ниже 5оС их рост полностью прекращается.

Сальмонеллы обладают сравнительно высокой степенью устойчивости к воздействию различных факторов внешней среды. В жидкой среде при прогревании до 70оС они погибают через 5-10 минут, а при кипячении моментально.

В то же время они хорошо сохраняются в различных пищевых продуктах (молоке, мясе, на поверхности и внутри яиц и др.). Соление и копчение оказывают на сальмонеллы относительно слабое действие.

Факторами передачи возбудителей инфекции при сальмонеллезах являются, как правило, продукты животного происхождения, в том числе молоко и молочные продукты.

В настоящее время чаще всего заболевания возникают при употреблении в пищу инфицированных яиц или продуктов, в состав которых входят яйца, в том числе кремово-кондитерских изделий. Ряд заболеваний связан с инфицированным сальмонеллами мясом и мясопродуктами. Чаще всего это мясо домашних птиц (куры, утки, гуси, индейки), а также крупного рогатого скота и свинина. Известны вспышки сальмонеллеза, связанные с употреблением рыбы и рыбных продуктов, в том числе рыбы горячего копчения и сельди пряного посола.

Инфицированными могут быть и продукты растительного происхождения (овощи, фрукты, ягоды), а также дрожжи, кондитерские красители и даже наркотические средства (марихуана).

Наибольшую опасность как возможные факторы передачи возбудителя инфекции представляют такие продукты и блюда, которые после приготовления не подвергаются термической обработке и могут храниться длительное время, в том числе и при комнатной температуре.

Следует учитывать и то, что даже при интенсивном размножении сальмонелл в пищевых продуктах они не изменяют ни вкуса, ни запаха, ни их внешнего вида.

Основными критериями эпидемиологической значимости определенных продуктов питания является обнаружение сальмонелл в пищевых продуктах или других объектах внешней среды.

Следует подчеркнуть, что в последние 20 лет во всем мире и в нашей стране широко распространилась Salmonella еnteritidis. Представители этого серовара вызывают пищевые вспышки сальмонеллеза при низкой дозе указанных микроорганизмов в продукте, а заболевания отличаются, как правило, более манифестным клиническим течением.

В настоящее время известны ряд схем, используемых в различных странах для выделения сальмонелл. В идеале для этого должны быть выбраны высокочувствительные и специфичные методы. В то же время эти методы должны быть простыми, быстрыми и недорогими.

Основными объектами окружающей среды, подлежащими исследованию на наличие сальмонелл, являются все пищевые продукты, а также остатки пищи, употребленной заболевшими, исходные продукты и полуфабрикаты, которые использовали при ее приготовлении, суточные пробы готовой пищи и другие подозреваемые в качестве фактора передачи возбудителя инфекции. А так же, смывы с различных предметов на эпидемиологически значимых объектах, в лечебно-профилактических учреждениях, вода (питьевая, открытых водоисточников, сточная), воздух и почва.

Лабораторным критерием диагноза является выделение возбудителя (сальмонеллы) из испражнений, мочи, крови, рвотных масс и промывных вод больных, а при необходимости и из желчи, дуоденального содержимого, спинномозговой жидкости и секционного материала.

Сложности с выделением сальмонелл связаны с наличием в кишечной флоре 1011 конкурентных микроорганизмов 300-400 видов, травмированием клеток при их транспортировке. Для преодоления этого при выделении сальмонелл обязательно используются среды обогащения: селенитовую, магниевую среды, RVS булон, а в качестве дифференциально-диагностических сред среды висмут-сульфит агара, SS-агар, XLD, Мак-Конки, Плоскирева.

Необходимо учитывать, что при исследовании различных материалов на инфицированность сальмонеллами отличаются только начальные этапы анализа (правила взятия материала, его обработка, выбор адекватных питательных сред). Начиная с отбора колоний на дифференциально-диагностических средах, последующие этапы бактериологического исследования идентичны.

После 18-20 часового инкубирования чашек с дифференциально-диагностическими средами (висмут-сульфит агар 48 час.) производится учет характера роста с отбором подозрительных колоний на одну из сред для первичной идентификации (Клиглера, Ресселя, Олькеницкого). У подозрительных культур изучают их ферментативные характеристики, позволяющие определить родовую и видовую принадлежность выделенных бактерий.

В дополнение к микробиологическому методу диагностики могут быть использованы серологический и молекулярно-генетический методы.

Большое диагностическое значение имеет нарастание уровня антител в динамике заболевания, для чего сыворотку нужно брать сразу после выявления больного, а затем в конце первой или в начале второй недели болезни. В более поздние сроки заболевания титр антител снижается, что также может служить диагностическим критерием.

Условно-диагностическим титром считается титр не ниже 1:320 для взрослых, 1:80 для детей до 6 мес. и 1:160 для детей старше 6 мес.

Положительным нарастанием титра антител считается их 4-х кратное увеличение по отношению к одному и тому же антигену.

При серологической диагностике сальмонеллезов большое диагностическое значение имеют иммуноглобулины, образование которых обусловливает нарастание титра антител в крови лиц, инфицированных сальмонеллами в определенные периоды жизни. При этом наиболее специфичны в диагностическом плане IgG-антитела. Вместе с тем IgM-антитела появляются в крови раньше других. Они могут образовываться и у здоровых лиц в результате «бытовой» иммунизации или вследствие ранее перенесенной инфекции.

При обработке сыворотки крови цистеином IgM-антитела инактивируются, тогда как IgG-антитела резистентны к этому препарату. В результате в РПГА выявляются только IgG-антитела, тем самым повышается специфичность реакции.

Достаточно высокий титр в РПГА с цистеином указывает на возможное хроническое сальмонеллоносительство или переболевание сальмонеллезом в течение последних 1-2 мес.

Молекулярно-генетические методы исследования в отношении микроорганизмов рода Salmonella обладают рядом особенностей, которые необходимо учитывать при определении оптимальной области их применения и правильной интерпретации получаемых результатов:

·         Объектом детекции является ДНК возбудителя, обнаружение которой не является доказательством жизнеспособности микроорганизма.

·         Аналитическая чувствительность различных тест-систем на основе метода ПЦР колеблется в пределах 100-500 бактериальных клеток/мл, и в ряде случаев может уступать аналитической чувствительности микробиологического исследования с использованием сред селективного обогащения.

·         При работе с продуктами питания обнаружение ДНК сальмонелл требует дополнительного микробиологического исследования для выявления культуры возбудителя.

Таким образом, молекулярно-генетический метод исследования является дополнительным к микробиологическому методу диагностики.

Исследования по оценке идентичности штаммов сальмонелл, в рамках комплексного эпидемиологического расследования, проводятся в референс-центре по мониторингу за сальмонеллезами в соответствии с приказом Роспотребнадзора № 1147 от 29.10.2015г. «О деятельности референс-центров по мониторингу за возбудителями острых кишечных инфекций и сальмонеллезов, функционирующих на базе ФБУН «ЦНИИЭ» Роспотребнадзора.

 

 

Зав. сан.-бак. отд.

микробиологической лаборатории

Н.Г. Молотихина

Дата: 10.07.2018